Nový článek v chemagíznu: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat

Nové technologie v posledních letech

V poslední době jsme byli svědky hned několika pokroků, které posouvají limity těchto technik na novou úroveň.

Za zmínku stojí především FTIR-FPA mikroskopie, která využívá plošného FPA (Focal-Plane-Array) detektoru. Jde o unikátní komponentu, kterou na trhu disponují pouze mikroskopy HYPERION II a LUMOS II od Německého výrobce Bruker Optics (viz obr. 1). Tyto plošné detektory oproti standartním jedno-elementovým detektorům obsahují pole až 128x128 detektorových elementů, a proto dokážou měřit rychlostí cca 15 tis. spekter/s. Tím v dosahují výrazně vyšší rychlosti mapování ploch. Tj. plocha, která by byla na klasickém FTIR mikroskopu měřena hodinu, trvá našemu mikroskopu pár vteřiny (viz obr. 2).

LUMOS II

Plně automatizovaný FTIR mikroskop pro chemický imaging

HYPERION II

Revoluční mikroskop kombinující FTIR a QCL technologii

SENTERRA II

Nový level disperzní Ramanovy mikroskopie

Obr. 1 – Pokročilé přístroje v oblasti FTIR a Ramanovy mikroskopie - FTIR-FPA mikroskop LUMOS II, FTIR-QCL mikroskop HYPERION II a Ramanův mikroskop SENTERRA II

Ještě větší pokrok v tomto ohledu přinesla FTIR-QCL technologie, která místo klasického zdroje IČ záření (žhavený globar) používá kvantový kaskádový laser (QCL). Záření emitované QCL je mnohem intenzivnější, a proto je možné je detekovat méně citlivými detektory známými např. z infrakamer. Tím lze dosáhnou rychlosti měření dokonce 90.000 bodů najednou. Porovnání různých přístupů měření najdete na praktickém příkladu na obr. 2.

Obr. 2 – Infračervená chemická mapa řezu tkání o rozměrech 14.7 x 5.9 mm. Pomocí klasické FTIR mikroskopie by měření trvalo cca 130 hodin, s FTIR-FPA mikroskopií 113 minut, v případě FTIR-QCL mikroskopie je tato mapa změřena za 8 minut!

I v oblasti Ramanovy mikroskopie jsme svědky mnoha inovací – ty souvisejí zejména s dokonalejší elektronikou a jemnou mechanikou, kterou tyto optické přístroje disponují. Proto nejnovější Ramanovy mikroskopy umožňují velmi rychlý pohyb vzorku a akvizici dat rychlostí, která mnohdy přesahuje 100 spekter/s. Příkladem může být např. Ramanův mikroskop SENTERRA II (obr. 1) s rychlostí měření 130 spekter/s.

Co na to počítače?

Je jasné, že tyto unikátní přístroje svým měřením generují obrovský objem dat – mnohdy i miliony spekter, takže se v podstatě bavíme o miliardách datových bodů! Se Všemi spektry musí počítač provádět matematické operace, musí umět spektra upravovat a zejména také vyobrazovat chemickou informaci v každém změřeném bodě/pixelu.

Tomu, aby toto bylo možné, napomáhá dnešní výpočetní technika – velká interní paměť RAM, rozsáhlé TB disky k ukládání dat i výkonné procesory. Nutností je také 64 bit software, který nemá limitovaný tzv. paging file a dokáže tak pracovat s různě velkými soubory dat. Nejdůležitějším aspektem pro to, dosáhnout potřebného výsledku a vytáhnout ze spekter žádoucí informace, jsou ( mimo zkušenou obsluhu) i softwarové nástroje a o těch se rozepíšeme v další kapitole.

Interpretace mikroskopických dat

Interpretace dat z FTIR i Ramanovy mikroskopie spočívá v tom, že v každém bodě máme změřené spektrum, které v sobě nese chemickou informaci. Každý bod v chemické mapě vybarvíme na základě nějakého atributu v tomto spektru. Typické je vybarvování na základě plochy pásu. Tj. pokud máme ve spektrech pásy C-H vazeb, čím více jsou tyto pásy přítomny, tím světlejší barvou se nám daný bod v mapě vybarví. Co když ale distribuce C-H vazeb v prostoru nepřinese dostatečnou informaci? Může se stát, že vůbec nevíme, na jakou část spektra se zaměřit, jaké látky se nám ve vzorku nacházejí a nebo dokonce o vzorku netušíme vůbec nic. Co potom? Pak přichází na řadu nejnovější verze spektroskopického softwaru OPUS, která disponuje velmi komplexním výčtem zajímavých funkcí, které nám pomohou jak se samotnou akvizicí dat, tak i s jejich vyhodnocením – pro představu tyto funkce uvádíme níže:

3D FOCUS FUSION – máte nerovný vzorek a nedaří se Vám zaostřit na větší plochu? Funkce 3D focus fusion vyfotí každou z oblastí zájmu se zaostřeným obrazem a snímky jednoduše spojí do jednoho ostrého snímku v celé ploše. Z-ovou souřadnici si navíc software zapamatuje i při měření, protože ohnisko je stejné pro viditelný snímek i pro měření pomocí IČ nebo Ramana. Nejen tedy, že můžete mít dokonale ostrý obraz, ale také maximálně kvalitní spektra. Ukázka na náseldující videu:

FIND REGIONS – chcete měřit jen v konkrétních bodech - např. jen částice na filtru? Není nic lehčího, než použít funkci Find regions, která Vám na základě kontrastu u klasického vizuálního snímku určí, kde částice leží a umístí do nich měřící body. Pokud tuto funkci zkombinujete i s funkcí MP-ID, každá částice je i automaticky identifikována a výsledkem je statistika identita vs. velikost částic.

SMART SPECTRAL CONTRAST – nevíte, kde se ve vzorku nacházejí rozdíly v chemismu? Použijte tuto funkci pro rychlou autonomní tvorbu vysoce kontrastního obrazu klidně i v reálném čase během FTIR a Ramanova mikroskopického měření.

ADAPTIVE CHEMICAL IMAGING – autonomní clusterová analýza, která pomocí zjednodušeného algoritmu nalezne spektrální rozdíly v mapě, včetně automatického přiřazení každého bodu do definovaných tříd/clusterů. Uživatel zkrátka dostane informaci o rozložení různých komponent v prostoru vč. průměrného spektra pro každou komponentu, aniž by o svém vzorku cokoliv věděl. V praxi se takto můžete dostat k velmi zajímavým mapám a také reprezentativním spektrům, bez jakékoliv znalosti vzorku. Ukázka využití funkce Adaptive chemical imaging níže.

TABLET ANALYZER – tato funkce je dedikovaná pro sledování API v tabletách ve farmacii, avšak její využití se nabízí i v mnoha analogických aplikacích. Spočívá v tom, že do funkce nahrajete mapu tablety a spektra čistých látek, které ve vzorku čekáte. Funkce už vám automaticky vypočte procentuální zastoupení pro každou čistou složku. Výstupem je pak přehledný report.

Toto je jen zevrubný přehled těch nejinovativnějších funkcí, ale každý měsíc až dva se od vývojářů dozvídáme o nových. Pokud vás kterákoliv z funkcí zajímvá více, doporučujeme využít youtube kanál výrobce Bruker, kde jsou veškeré výše zmíněné funkce pěkně demonstrovány na reálných příkladech.

Jaká bude budoucnost?

Technologie jdou neustále dopředu a s rozvojem toho, co dnešní mikroskopy dovedou změřit jde logicky ruku v ruce i pokrok v softwarovém vybavení. Na několika nových a velmi inovativních funkcích spektroskopického softwaru OPUS jsme si ukázali, jaké jsou dnešní možnosti z hlediska zpracování chemických map a také to, že je možné vytáhnout velmi zajímavé informace, dokonce i ze zcela neznámých vzorků. Toto je směr, kterým se FTIR i mikroskopie bude do budoucna vyvíjet – až ke zcela autonomnímu vyhodnocení dat založeném na AI. My se u toho budeme snažit být s vámi a budeme vás i nadále informovat.

Ing. David MATOUŠEK, OPTIK INTRUMENTS s.r.o., david.matousek@optikinstruments.cz

Ing. Jan NEUMAN, Ph.D., OPTIK INTRUMENTS s.r.o.